灌流系统中的产物质量属性漂移 – II：阐明细胞机制
本系列的第I部分（灌流系统中的产物质量属性漂移 - I：如何在漂移发生时鉴定漂移）描述了以灌流细胞培养生产的蛋白质产物质量属性（PQA）发生漂移的潜在原因调查和控制方式。体积排阻高效液相色谱（SEC-HPLC）分析显示的低分子量(LMW)物种的存在是一种蛋白质质量属性,可以表明所表达蛋白质和/或其它LMW模体截短形式的增加。本研究中表达的蛋白质是一种高度糖基化的重组糖蛋白(rGP)，包含两个亚基：210 kda重链(HC)和80 kda轻链(LC)。
图1:体积排阻色谱(SEC)结果显示了三个主要区域:高分子量(HMW)物质，产物主峰和低分子量(LMW)物质。蓝色图谱是典型的产物结果；红色的是非典型结果，显示低分子量峰偏高，产物峰降低，高分子量峰无明显变化。
在常规的细胞培养运行中，药物底物(DS)阶段的SEC显示出LMW水平的变化(图1，红色)。确定问题的根源是随着灌流培养运行时间的增加，细胞在细胞生物反应器基于重力沉降的细胞截留设备中的滞留时间增加所致(图2)。在此运行中，增加的细胞聚集会导致滞留在细胞截留设置中的细胞生物质的比例增加。一种可以检测聚集的方法是监测细胞废弃的变化(图2)。当细胞在积聚在装置中时，返回到生物反应器的细胞就会减少，这反过来降低了培养对氧气的需求。生物反应器中降低的氧气需求减少了细胞的废弃量。
此前在拜耳进行的研究(未显示)表明，低细胞特异性灌流速率(CSPR)也会在SEC中提高LMW，因为它也会增加在细胞截留装置中的滞留时间。这些见解使我们能够建立一种策略，通过工艺输入(未显示)来控制LMW水平。为了使控制蛋白PQA和/或防止高LMW水平的最佳方法成为可能，我们需要确定为什么在细胞截留装置中滞留时间的延长会导致在SEC色谱中LMW向上漂移。如下面所述，这一认识可以提供重要的诊断工具，以便及早鉴定高LMW偏差，从而及时进行预防性工艺控制。
图2：灌流细胞培养系统的一般设置，包括生物反应器(左)、细胞截留装置(中)和收获罐(右)。来自生物反应器的细胞在进入截留装置(2)之前经过冷却，其中大多数细胞在重力作用下沉降并返回到生物反应器。无细胞的收获物被收集以作进一步处理。生物反应器内的探头测量溶解氧(DO)来控制细胞废弃。细胞在截留装置中的累积增加了它们进入收获液流的可能性，进而降低了细胞废弃。
调查
因为细胞截留设备控制在比生物反应器更低的温度，细胞累积在设备内会增加暴露于低温的细胞生物质比例。因此，我们假设高LMW结果可能由于细胞累积在截留设备内而导致其长时间暴露于低温条件(图2)。但是为什么细胞暴露于低温条件会影响LMW?接下来，我们假设了一种细胞机制，并提供了实验证据，证明了培养细胞暴露在低温条件下是如何导致表达蛋白的截短形式短暂增加的。
位点特异性切断：LMW在SEC后离散的尖峰(图1)表明rGP位点特异性切断。这与非特异性降解不同，非特异性降解表现为一个浅峰区域，代表截短模体的广泛分布。位点特异性切断说明有一种酶的参与，该酶在特定位点切断蛋白，产生以SEC LMW区域为代表的物质的分子大小。糖蛋白的特异性酶处理确实发生在它们的分泌途径上。与大多数蛋白质一样，新生的rGP通过细胞内分泌机制进行处理(图3)，在此过程中，它通过内质网(ER)和高尔基体隔层进行囊泡运输，并经历多种翻译后修饰(PTM)。最后，将其分泌到细胞外的培养基中，从培养基中收获、分离并纯化为药物底物，然后进一步加工成药物产品。
跨高尔基网络(TGN)是特异性处理酶存在的一个关键地方。分泌途径中的不同步骤具有不同的温度需求。在细胞截留设备中的低温条件阻碍了从TGN的分泌，如模式膜糖蛋白所报导的。需要注意的是，这种分泌阻碍可能无法阻止终端糖基化。此外,一旦细胞返回到正常生长温度条件(如在生物反应器中)，低温分泌阻碍是可逆的。在不同类型的货运蛋白中也很常见。所有检测的蛋白在低温下都在TGN中积累，并在升温后同步释放。
图3：糖蛋白通过重组细胞的胞内机制加工处理。黄色箭头表示在跨高尔基体网络(TGN)中发生温度阻滞的的位置；ER =内质网。
低温会影响rGP的分泌。由于许多糖蛋白的分泌在低温下受阻，我们测试了我们的细胞在截留装置中暴露于低温是否会影响rGP的分泌。为此，我们建立了一个分泌实验：在高(代表生物反应器)或低(代表细胞截留装置)温度下小规模孵育6小时，并在给定的时间点收集样本。样品离心，然后使用Western blot以密度法分析上清液和裂解细胞颗粒中的蛋白。
我们使用rGP特异性抗体，并对稀释液进行归一化处理，以代表培养样品中的活细胞密度(VCD)。正如预期的那样，我们发现在较低的温度下，rGP的分泌量 - 定义为上清液中标准化rGP蛋白与裂解颗粒中的比例 - 随着时间的推移显著降低(图4)。
需要进一步的实验，通过标记新生糖蛋白和/或使用蛋白合成抑制剂，然后进行细胞内分离，进行脉冲/追踪，以解释在较低温度下rGP生物合成(转录和/或翻译)降低的原因，并确认/鉴定分泌阻碍的特定细胞内位置。虽然我们无法解释生物合成降低的原因，但低温的快速影响(早在30分钟时就可观察到)与细胞内分泌的阻碍是一致的。
图4：分泌检测结果显示，相对于对照组，低温处理培养物的上清/裂解颗粒中存在分泌的时间依赖性阻碍，以标准化的rGP蛋白表示。
然而，低温对rGP分泌的影响，也有可能是由于在截留装置中细胞聚集，导致更大比例的rGP被保留在TGN中并暴露于蛋白酶活性。
根据其氨基酸序列(未显示)，本研究中表达的rGP包含TGN中已知的细胞内蛋白酶的两个特定的一致切割位点，该酶参与随分泌途径的蛋白质底物的“成熟”。预计其中一个位点的优先切断将产生~120 kda的片段。我们预计，在SEC中，该片段将在LMW区域下确定(如果发生进一步的蛋白水解，则稍后)。相应的HC会缩短为~170 kDa(如果发生额外的蛋白水解，则会更低)。
构象差异：蛋白酶在含有特定氨基酸基序的特定位点切割蛋白质的能力取决于底物的三级结构以及切割位点周围的氨基酸。此外，低(或高)温度可以影响新生蛋白质的折叠，最终决定糖蛋白的构象(以及它对蛋白质水解的敏感性)。在降低的温度条件下，我们表达rGp的细胞培养可能会发生一些关键的变化，产生更高比例的~120-kDa片段，从而导致LMW物质水平的升高。上述实验支持低温诱导的分泌抑制，这也会促进新生糖蛋白在TGN中的截留。它还表明，蛋白质构象的改变可以使特定的蛋白水解位点更容易被蛋白酶消化(和/或蛋白酶序列特异性的改变)。我们通过下面的实验进一步探索了这一机制。
工艺分析：知道LMW漂移即将来临，同时还可以改变控制培养参数(例如，缓解截留装置中的细胞聚集，以减少细胞暴露于低温条件)，这将是非常宝贵的。然而，当rGP底物进行SEC分析，并且潜在的高LMW可以被鉴定出来时，它已经被充分纯化 - 对于纠正措施来说已经太晚了。因此，我们探索了利用对rGP有高度特异性的抗体以及使用纯化的生物反应器粗收获样品，结合上述细胞内机制见解，以更早地了解rGP的完整性(LMW偏移的可能性/增加)。
图5：来自两个生物反应器的细胞培养批次样品的Western blot：用抗-LC偶联磁珠rGP pull-down后的正常(4通道)和高LMW(5通道)，以抗-LC(图a，左侧)或抗-HC(图b，右侧)抗体探测。作为80-kDa LC和210-kDa HC的参考(分别在图a和图b中)，纯化的rGP以两种浓度(2通道5 IU /mL，3通道 1 IU/mL)上样。1通道为分子量标准。顶部的红色箭头显示，相对于正常的(4通道)生物反应器，高LMW (5通道)的120-kDa条带增加(a)，140-kDa条带减少(b)。
为此，我们使用正常（标准）生物反应器的培养收获样品以及被证明为高LMW的样品，以结合了抗LC抗体的磁珠进行了“pull-down”实验，在以抗LC或抗HC抗体进行了WB实验(图5)。证实有高水平LMW的生物反应器运行（高于最大阈值）的样品显示120 KD arGP LC源性条带的增加以及140 KDa HC-源性条带相应的降低(图5 a和5 b中的红色箭头所示)。使用抗LC抗体在还原十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)下检测到120-KDa片段，表明它由80-KDa的LC和40-KDa的部分组成，导致更高分子量的LC衍生物质。140-kDa条带是HC的一个典型衍生物。
这些结果支持了这样一种机制，即LMW蛋白水平的增加可能是由于糖蛋白分子LC的蛋白水解位点优先切断所致，继而产生120 KDa片段。结合WB分析观察到的条带变化，这种机制是可以解释的，并可根据蛋白水解位点在所表达的rGP氨基酸序列上的位置进行预测。当细胞在细胞截留装置中积累/聚集而暴露于相比生物反应器更低的温度时，可能会增加蛋白酶的暴露，因为低温会阻滞TGN (蛋白酶驻留的细胞内腔室) 中的糖蛋白。
观察到的WB条带的变化可以作为存在高LMW异构体的培养的早期诊断或预测指标。使用未纯化的收获样品进行抗体pull-down实验以及WB，可以检测出表明该PQA改变的条带模式的变化。更早地鉴定这些变化可以避免多天的延迟，否则需要在随后的多个纯化步骤后评估LMW水平(因为SEC需要使用高度纯化的药物底物样品)。
图6. 相关蛋白酶消化（和未消化）的纯化rGP凝胶的考马斯蓝色；M通道为分子量标准，1通道为蛋白酶消化的rGP，2通道为假孵育的rGP (不含蛋白酶)。右侧红色箭头指向未处理样品(2通道)的210-kDa条带；左边一个红色箭头指向120 kDa条带的蛋白酶处理样本(1通道)。消化使用的蛋白酶的量太少，考马斯蓝色检测不到，但在银染和SEC-HPLC（图7）中可观察到代表蛋白酶的新条带。
蛋白酶消化：接下来，我们测试了我们的rGP是否可以作为相关蛋白酶的消化底物。体外消化实验表明，纯化的rGP可被蛋白酶消化(图6)。此外，~210 KDa条带(短的红色箭头,右侧)代表未消化样品中rGP的全长HC，其被切断成~120 kDa条带(红色箭头,左侧)，这是rGP氨基酸序列中公认的蛋白酶切位点。其它的片段代表了预期的80 kDa的片段以及额外的(二次酶切)片段，其可能是在蛋白酶位点切断后，rGP分子结构的变化而导致的。值得注意的是，由于rGP分子的高度糖基化，我们预计HC、LC和片段的迁移会更慢，显示出明显高于理论分子量的表观值。这些结果表明，我们的rGP可以在体外作为蛋白酶的底物；也支持可能存在其它蛋白水解位点的推论。
为了研究与抗LC抗体反应的120-kDa蛋白酶消化产物(图5，图A)是否是在LMW水平下分解并增加的同种物质，我们将蛋白酶消化的纯化rGP进行SEC-HPLC分析。在大规模实验中，我们将蛋白酶消化的rGP、未消化的rGP和蛋白酶单独(作为对照)进行SEC-HPLC。等量的反应后样品进行银染SDS-PAGE分析，以确认蛋白酶的消化：以210-kDa条带代表的全长rGP分解为120-kDa和170-kDa物质，与预期一致(图6)。接下来，等量的反应后样品进行SEC-HPLC分析。
图7为得到的SEC-HPLC图谱。蛋白酶消化后的rGP在HMW物质和rGP产物峰上均无明显差异，LMW物质显著降低。然而，在LMW之后可看到一个新的峰。蛋白酶单独洗脱在LMW区域，基于其分子量，与预期一致。
我们的结果在三个独立的实验中得到了重现，但并没有完全复制当细胞累积在细胞截留装置内时生物反应器中所观察到的LMW的增加。它们也不代表高-LMW生物反应器样品和蛋白酶消化的rGP样品在SDS-PAGE上所观察到的120kDa条带的增加。尽管如此，新峰的出现 - 表明比LMW区域4更小的片段(图7中的红色箭头) - 表明在SEC-HPLC中可能发生了120-kDa物质的进一步蛋白水解或降解。这可能是由于基质效应或在蛋白水解和HPLC运行时缓冲液的不相容性所致。支持基质效应是因为与药物底物色谱图相比，可观察到差异(特别是HMW区域) (图1)。蛋白酶消化的rGP和未消化rGP在产物峰之间的重叠(完整rGP，图7)指示蛋白酶消化对完整rGP水平的影响较小，从SEC-HPLC结果可见。
图7. SEC-HPLC图谱显示蛋白酶消化后的rGP (红色)，未消化后的rGP(蓝色)，仅蛋白酶(绿色)。HMW、产物峰和LMW是三个主要区域；红色箭头指向蛋白酶消化的rGP样本中观察到的新的肩峰。
可能的细胞机制
我们的实验数据表明，事件发生的顺序如下:
灌流运行时间延长(可能还包括未知的触发因素/变量)。
细胞聚集并累积在细胞截留装置内，可能是由于细胞密度的增加和/或细胞特异性灌流速率的降低所致。
培养的细胞暴露在较低的温度条件下，导致细胞内rGP的积累和分泌阻滞。
蛋白水解过程(导致LC中明显的分子量变化)使120-kDa片段的存在高于正常水平。
SEC-HPLC中，120 kDa片段可能在LMW处共溶解(并导致LMW的增加)。在SEC-HPLC过程中进一步的片段化可能导致较小的LMW物质。该片段(及其衍生物)可能会与LC竞争性结合至纯化中使用的包被抗LC抗体的磁珠。这解释了柱纯化步骤中观察到的步骤收率下降的原因。
如第1部分所示，细胞在截留装置内的累积是可纠正的，其会在SEC-HPLC(表现为高LMW)和SDS-PAGEWB(表现为120-kDa片段的增加)中导致截短的rGP的增加。在SDS-PAGE中，蛋白酶消化复制了观察到的120 kDa条带的增加。虽然这并没有完全复制LMW的增加，但在代表更小LMW物质的区域观察到了增加(红色箭头，图7)，表明120-kDa/LMW物质进一步发生蛋白水解/片段化。将需要更多的工作(消化后的分馏)以优化与SEC-HPLC兼容的蛋白酶消化，但这将需要大量纯化的rGP和酶/蛋白酶。生化和显微方法(包括免疫染色后成像和/或亚细胞分馏技术)可用于进一步探索低温(和其它关键培养变量)对rGP细胞内运输和翻译后修饰(如糖基化)的影响。蛋白质组学和代谢组学也可以用来了解灌流(或补料分批)培养的宿主细胞中所涉及的特定基因和通路。
针对产物质量的工艺控制
在本报告的第1部分中，我们描述了通过SEC确定LMW物质高水平的根本原因的调查过程：随着灌流细胞培养运行时间的增加，细胞滞留在细胞截留装置中的时间增加。聚集细胞在截留装置中的累积，导致它们在低温条件下暴露的时间延长，因为细胞在装置中的滞留时间相对于生物反应器增加。因为细胞截留设备控制在比生物反应器更低的温度。细胞在截留装置内滞留时间的增加是多种变化的结果，如聚合、CSPR降低和/或高细胞密度。事实上，设备控制的变动可以成功解决LMW的增加。
这里描述的实验数据所支持的细胞机制阐明了低温如何通过改变分泌导致表达的rGP的片段化，这会影响细胞内的蛋白水解活性。有了这种对细胞水平的机制理解，我们可以设计出一种早期检测的实用方法，并进一步控制灌流模式系统中表达的蛋白质的质量属性，防止出现超出规格范围的结果。
原文：L.P.Pathange, Y.Shimoni, V.Srinivasan, Product Quality Attribute Shifts in Perfusion Systems, Part 2: Product Quality Attribute Shifts in Perfusion Systems, Part 2: Elucidating Cellular Mechanisms. Bioprocess International, 2020.
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