mRNA疫苗：当前趋势和展望
COVID-19大流行期间，辉瑞/BioNTech和Moderna迅速推出了高效疫苗(94-95%)，使mRNA疫苗成为行业关注的焦点。在SARS-CoV-2序列公布后，Moderna仅在28天内就有了第一批候选疫苗。完整的I - III期试验和数百万剂疫苗的放行在几个月内就完成了，这比其它疫苗通常需要的几年时间要短得多。
除了开发时间短、疗效高 (至少对COVID来说是这样) 外，将mRNA用于预防和治疗性疫苗还有其它优势。一个是安全性，这包括抗原通常只有几天的表达时间，且可以通过mRNA的设计来调节。mRNA疫苗也比减毒疫苗和载体疫苗更可控。与基于DNA的方法不同，mRNA疫苗不需要进入细胞核，因此基因组整合和突变的风险较小。最后，mRNA疫苗提供了细胞和抗体反应的强大推力，这可以通过mRNA的设计、递送方法的选择以及其它方法在两者之间进行调节。
生产方法也有优点，因为合成是建立在无细胞系统的体外转录过程。无细胞系统有助于降低成本、时间安排和生产占地。值得注意的是，作为mRNA疫苗模板的pDNA需要基于细胞的发酵步骤，但这并不被认为是一个昂贵或耗时的步骤。此外，mRNA疫苗的灵活性还在于，可以在不显著改变生产工艺的情况下，制造针对变异株的疫苗或多价疫苗。然而，仍有一些领域需要改进。
由于带负电荷，mRNA很难进入细胞，且其可被核酸酶(如RNase)迅速降解。通过脂质纳米颗粒(LNP)包封(也会目前基于mRNA的COVID疫苗使用的方式)、修饰碱基的替换、mRNA的设计或其它方法，可以在一定程度上缓解这一问题。另外，也可以采用物理方法，如电转，这种方法在体外给药的治疗性肿瘤疫苗中获得了一些成功，但效率不是很高。
此外，疫苗的分发也是一个问题，目前的产品需要冷冻储存。替代方法，如冻干，正在研究中。因此，mRNA疗法是一种令人兴奋的新兴治疗方式，但仍有一些领域需要改进和成熟，如生产、管理和供应链方面。
从生产的角度来看，有许多挑战。mRNA工艺的主要挑战之一是缺乏专用设备和耗材，与传统的重组蛋白相比，这些设备和耗材需适合体积较小且粒径较大的mRNA产品。在优化可放大性和工艺一致性的许多步骤中，技术开发也有改进的空间。
基于RNA的治疗药物的开发趋势
1990年，在将裸mRNA注射到小鼠骨骼肌并观察到蛋白质的体内表达后，mRNA疫苗的潜力就引起了科学界的关注。从那时起，该行业得到了快速的发展和扩张。今天，全球已经启动了140多项临床试验，以利用mRNA来解决各种疾病，如传染病、肿瘤和其它各种可能的应用领域。
目前正在开发的mRNA结构包括两种形式：传统的非复制mRNA和自扩增mRNA。非复制型mRNA疫苗具有传统的mRNA形式，不具备mRNA序列内的复制能力。抗原序列侧面为非翻译区(UTR)，3' poly (A) 尾和5'帽。帽、UTR、ORF和尾可以定制设计，以上调或下调表达水平，或调节免疫反应。修饰的核苷酸，如假尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶可以用来减少不希望出现的固有免疫系统反应，并提高翻译效率。因此，临床响应的许多方面可以简单地通过mRNA的设计来调节。
非复制mRNA疫苗本质上是一种“瞬时”产品，通常抗原表达时间为数小时或数天(辉瑞和Moderna疫苗的细胞半衰期估计为8-10小时)。对于某些应用来说，这可能是有益的，但对于其它应用，如全身蛋白治疗，延长蛋白表达将是有益的。
自扩增mRNA (saRNA)方法也在开发当中，其可使mRNA能够复制。这可以将表达窗口扩展至数周。一般来说，saRNA基于以顺式或反式构型加入来自甲病毒、黄病毒或小核糖核酸病毒的病毒复制酶基因。这些策略可以增加表达水平或使mRNA剂量需求降低10-100倍。自我复制的mRNA有可能在许多方面扩展mRNA技术，同时降低制造需求。mRNA技术的许多领域都在发展和优化，mRNA的设计和优化是当前工作的重要方面。
除了mRNA之外，还有其它类型的RNA疗法正在被开发或已经被批准。其中包括反义寡核苷酸，其修饰基因表达；小干扰RNA(siRNA)，其也可通过不同的机制修饰基因表达；适配体，其可结合其它配体，包括RNA；引导RNA，其用于CRISPR靶向；以及其它功能性RNA。这些RNA疗法中的许多技术与mRNA疫苗有一定程度的技术重叠。一个例子是使用LNP技术、已获批准的siRNA治疗Onpattro©。因此，除了mRNA疫苗外，整个RNA治疗领域也在迅速发展。
基于mRNA的不同治疗产品类型
COVID-19疫苗是针对传染病的预防性疫苗。还有许多其它的预防性疫苗正在研发当中，包括流感、寨卡病毒、登革热、狂犬病、委内瑞拉马脑炎疫苗，以及针对葡萄球菌和结核病等细菌感染的疫苗。
mRNA疫苗作为一种治疗肿瘤的方法也获得了极大的关注。mRNA可用于诱导针对突变肿瘤基因或调控性肿瘤基因的免疫反应，如p53，在治疗泛肿瘤方法中，许多肿瘤共享这些基因。
其它肿瘤治疗方法包括个性化治疗，即针对个人的肿瘤突变开发疫苗。在这方面，患者的变异基因组将通过二代序列确定，一些定制的mRNA疫苗将针对个体的特定新抗原而开发。
治疗性肿瘤疫苗的开发进展迅速，包括70多个已完成的临床试验，且预计在未来2-3年内将获得结果的更多试验。许多技术正在被评估当中，包括直接刺激抗原提呈细胞(APC)，通过体外电转的mRNA。其它方法包括直接肿瘤内注射、全身方法以及靶向器官方法。目前，使用mRNA的临床试验中，超过50%都集中在黑色素瘤、前列腺癌和脑癌的治疗上。因此，mRNA疫苗的应用有很多，处于从概念验证到临床试验的不同开发阶段，尽管使用LNP以靶向特定器官、组织和细胞的研究仍在进行中。
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mRNA疫苗生产的瓶颈
针对某一应用所需的mRNA的规模因适应症、方法的效力、市场需求以及其它各种因素而异。定制的个性化应用可能只需要生产数毫克的mRNA。而对于全球化需求产品，需要更多的mRNA产能。例如，目前辉瑞和Moderna的COVID-19疫苗每剂分别含有30μg和100μg非复制mRNA。在这种情况下，生产10亿剂疫苗需要生产30-100kg高度纯化的cGMPmRNA，每个生产批次的产量至少需能达到数克。
目前mRNA生产中最常见的瓶颈之一是规模放大。随着COVID-19疫苗达到数十亿剂的规模，当然需要更大规模的生产技术。然而，在较小规模的cGMP生产中，也需要进行优化工作，因为当前的许多设备是对其它生物技术行业中所使用设备的“再利用”，而这些设备往往是为了生产比mRNA所需的更大的规模而设计的。如果能针对mRNA cGMP生产专门设计设备，包括小规模设备，该行业将大大受益。
mRNA的上游生产过程已经相对成熟。市面上已有符合cGMP质量要求的质粒、聚合酶以及体外合成mRNA所需的酶，但价格昂贵。Poly A尾可以通过将其包含在模板当中或使用酶来产生。目前已有高效、共合成的加帽选项，如CleanCap©或者其它通过酶处理高效进行的替代性加帽途径。mRNA疫苗由于其无细胞的特性，有可能比其它疫苗方法更便宜，但目前它们的生产成本可能反而更高。为了优化整体成本，需要降低GMP试剂、加帽试剂、LNP成分以及其它专用成分的成本。在mRNA生产过程中作为起始模板使用的质粒的产能限制也是这一应用领域与日益增长的病毒载体领域共同面临的挑战。很多公司都在寻求消除这一瓶颈的方法，围绕无细胞工艺的质粒生产新技术可能会改善这一初始过程步骤。
下游生产更需要优化。高效的翻译需要高纯度的mRNA，同时也是为了减少不良的免疫反应。因为工艺中往往存在多种杂质，包括酶、核苷酸、质粒模板、异常RNA物质等，目前的生产通常需要多步纯化操作。不同开发商的多步工艺可能会有很大的不同，其可能包括沉淀、亲和oligodT层析、离子交换层析、切向流动过滤(TFF)以及其它可用的技术。更高效的纯化配基以及精简的纯化工作流将使行业大大获益。此外，分析方法也需要进一步的优化和标准化。
虽然mRNA的生产最终肯定会走向标准化和平台化，就像在单克隆抗体行业所发生的那样，但目前的大部分生产是使用特定的设备以多个步骤进行的。其它方面，如一次性使用技术和连续工艺策略，也将有利于这个新兴行业。
mRNA技术的速度和潜在的成本收益使其成为一种有趣的个性化医疗技术，此时，需开发针对个人肿瘤突变的疫苗。许多公司都在研究基于整合式系统的mRNA工艺解决方案。尽管该工艺过程中的许多步骤是相同的，但由于规模和成本，还存在一些额外的挑战。但我们正在见证这一领域的发展，在未来几年内就可能达到商业化阶段。
最后，有必要进一步了解这一过程的科学原理。例如，LNP通常是在使用微流设备的快速混合过程中形成的，这更像是一门艺术，而不是一种既定的方法。更深入地了解LNP成分的影响，以及它们对LNP稳定性、递送、效率、免疫反应以及最终患者预后的影响，将有利于行业的发展。LNP和其它递送技术的优化是决定治疗最终成败与否的关键因素。
包封和递送技术
纳米结构 (如LNP) 的使用在mRNA治疗中很常见，因为它们可通常比裸mRNA提供更高的效率，并允许进行多种不同的给药途径。纳米结构技术的一个挑战是，它本质上的复杂性，且涉及许多潜在的成分，可能导致不同的潜在临床结果。行业在这方面的理解还不完全。纳米结构特性对临床结果至关重要，包括：核酸的保护、细胞内RNA的可控释放、细胞和组织的选择性、翻译效率、毒性以及长期稳定性等。
siRNA-LNP和mRNA-LNP结构的模型示意图。A：多层囊泡；B：纳米结构核；C：均质的核壳（L. Schoenmaker et al.，2021）。
纳米结构的结构复杂性在于其可能由多种成分组成，如普通脂类、聚合物 (PEG、PEI、聚赖氨酸等)、蛋白质、胆固醇或定制的专有成分，如可离子化脂质。通常还可能使用偶联物，如PEG-脂质。这其中的每一种都会对其性质产生显著的影响。例如，聚合物含量可以控制颗粒大小、影响效率和细胞趋向性。结构性脂类，如胆固醇，会影响颗粒的稳定性。如果没有正确混合，可能会形成没有有效载荷的空纳米颗粒。因此，纳米结构的组成和形成对预期的临床效果至关重要。目前，LNP是包括基因治疗在内的许多系统的常见非病毒递送系统。
此外，还有其它递送方法正在研究和开发当中。外泌体被认为是一种受体，具有更高效的摄取、更强的特异性以及更少的副作用。这是一个很有前景的早期研究领域。其它方式包括偶联的RNA，如已被证明可靶向肝细胞的GalNac-siRNA。同样地，已有研究证明GALA-肽偶联的mRNA可提高抗原提呈细胞的摄取。还有更多的其它方法正在评估中，以提高目标特异性或优化细胞摄取。
mRNA行业展望
随着COVID-19大流行的到来，用作预防性疫苗的mRNA因迫切需求而成为公众关注的焦点。这些疫苗通过其快速的开发时间以及高效性而证明了mRNA疗法的前景。虽然COVID疫苗的成功值得注意，但迄今为止，大多数mRNA产品都专注于肿瘤治疗，目前已有数十个正在进行中的临床试验。在接下来的2-4年里，许多试验将会完成，包括多个个性化肿瘤治疗疫苗。这一领域积极的结果可能会进一步推进mRNA产业。
此外，在不同的领域，还有许多处于早期开发阶段的治疗方法，如果获得成功的话，将会产生极大的影响。mRNA疗法的成功可能在未来取代目前疗效较差的治疗方法，如传统流感疫苗、结核病疫苗以及其它一些应用。
参考文献：
L.Schoenmaker, D.Witzigmann, J.A.Kulkarni, et al., mRNA-lipid nanoparticle COVID-19 vaccines: Structure and stability. Interntional Journal of Pharmaceutics, 2021, 601.
D.Kumari, B.D.Prasad, P.Dwivedi, et al., COVID-19 Vaccines: A possible solution to ongoing pandemic. The Pharma Innovation Journal 2021; 10(5): 1142-1145.
A.Lennon, Are COVID-19 vaccine boosters the way forward? Medical News Today, 2021,https://www.medicalnewstoday.com/
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