利用稳定生产细胞系开发商业化慢病毒载体生产工艺：下游工艺考量
本文节选自GSK细胞 & 基因治疗上游载体工艺开发团队主管Peter Archibald和下游工艺开发经理Anthony Shillings发表的文章“Enabling development of commercial-ready lentiviral vector manufacturing processes using stable producer cell lines”，由于水平有限，详细内容，请参考原文或往期推送“利用稳定生产细胞系开发商业化慢病毒载体生产工艺：上游工艺考量”。
LVV 下游工艺考量
对于LVV的下游工艺，生产的平均总收率估计为31%。这种工艺中转导单位(TU)的高损耗可以归因于许多因素，如相对较低的稳定性以及LVV受限的生理范围。此外，当放大到大批次(200 - 500L) 时，在下游工艺中实现批次间一致性的挑战经常出现。确保产品质量以及达到所需的感染性滴度的要求，仍然是开发稳健LVV下游工艺的主要影响因素。在LVV生产中使用稳定PCL为解决这些问题提供了许多优势，但也带来了一定的挑战。
为了提高工艺的总滴度，上游工艺通常有这样一个驱动因素，即促进细胞密度更高的培养(例如，灌流模式)，以及提高随后进入下游工艺的TU。然而，在处理如此大体积的LVV收获料液时，使工艺时间和剪切应力最小化的要求是对工艺产量影响最大的因素之一。这在很大程度上是由于慢病毒颗粒的相对不稳定性，其部分是由于其囊膜脆弱，这对分离技术来说，需要一个狭窄的生理“窗口”。通常，下游单元操作在pH值7+/-1范围内进行，同时保持低渗透性和低温的环境，以维持病毒颗粒的稳定性。温度的影响是维持载体稳定性的主要抑制因素之一，工艺通常需保持在12°C以下，以保持载体的完整性。与许多单抗工艺相比，即使对工艺进行了缩小操作条件范围的考虑，载体的稳定性仍然是一个问题，典型的纯化需在48小时内完成就证明了这一点。正是这种与时间相关的压力，促使下游工艺开始时依赖于高流速的单元操作，以进行培养液“脱水”，并实现后续工艺的可操作性。这必然会带来一些风险，包括由于剪切而产生的一些工艺相关杂质。这也部分解释了整个工艺过程中对具有低温保护特性的缓冲液的依赖，以努力保护病毒免受工艺相关的应激。
图3. 下游工艺可能使用的不同单元操作的顺序
切向流深层过滤（Tangential Flow Depth Filtration，TFDF）工作原理
图3总结了下游LVV工艺所采用的典型单元操作。一些最大的应激往往是在工艺的开始和结束阶段产生的。这包括生物反应器物料收获澄清中的过滤、以及最终灌装前载体的生物负荷降低操作。对于澄清，这部分是由于使用了某些深层过滤，其传统上使用特定孔径的膜将细胞质从上清液中分离出来，以确保充分降低生物负荷。澄清单元操作可能会受到瞬时转染过程中引入的高水平DNA的影响，因此使用稳定PCL可能是有利的。DNA水平通常会导致更高的粘度，对所有形式的过滤都会产生更高的背压，但也在与病毒颗粒的相互作用和结合中发挥着关键作用。虽然可以通过适当的深层或平板过滤器尺寸来解决，但如果在收获时达到了显著更高的细胞密度和更低的细胞活性，稳定PCL工艺也可能会有些挑战性。在更高的细胞密度下生产LVV，可能会导致在收获时细胞健康状况下降，并导致宿主细胞蛋白质和DNA含量的升高，而纯化需以此为基础开始。此外，由于这些过滤器负载的增加，跨膜压(TMP)的增加会导致更高的载体剪切和细胞破坏，这将释放与组蛋白和其它核蛋白相关的复杂DNA混合物，其会产生一系列带不同正电荷、负电荷和疏水性范围的多电荷复合物。一种解决过滤澄清问题的方法是使用离心。这种方法为在复杂细胞培养中对载体施加的应激提供了一种替代方法，并允许使用更宽泛的操作参数。然而，随着生物反应器体积的增加，这类方法的可放大性变得更加具有挑战性，可能需要采用新的技术，如固体连续排放离心。
对于DNA相互作用在LVV下游工艺效率中的影响，最常见的解决方法是使用内切酶代谢掉收获物料中的大量DNA。根据下游工艺单元操作的顺序和/或一旦使用后清除残留内切酶的捕获步骤的效率，其可在工艺过程中使用一到两次。事实上，TU/DNA和TU/宿主细胞蛋白(HCP)之间的比率可以作为慢病毒纯化既定工艺效率的一个指标。
一般来说，使用层析作为捕获步骤来降低体积并纯化来自澄清的物料是非常常见的。基于结合的作用模式，无论是阴离子交换、疏水作用，还是非特异性的亲和作用(如基于肝素的填料)，层析法为纯化LVV提供了更大范围和更高的选择性。无论用于结合载体的配基是什么，由于维持LVV稳定性的生理范围狭窄，以及表达的病毒颗粒的混合粒径分布(80-120nm)，高细胞密度培养对这些模式都是一个重大挑战。因此，基于扩散进入基球的层析动力学在结合和分辨HCP和DNA时更强大，而不是慢病毒本身，后者主要通过对流传质结合。这导致了膜和整体柱技术的使用，其提供了高孔隙度的通道以及更高的流速，以处理大体积料液。尽管如此，在收获材料中实现对可能与LVV共洗脱的污染物的分离/选择的挑战在很大程度上是由配基的选择和配基的密度所驱动的。正因为如此，开发一种基于亲和的LVV层析形式，特别是稳定PCL收获材料的处理，将为未来的捕获、纯化和浓缩提供强有力的工具。就大规模工艺而言，这一进展将完全依赖于这种填料的开发，其将使用稳健的骨架来实现合适的流速特性，以及与LVV在生理上相容的洗脱剂。虽然这种模式可能是未来工艺的一个选择，但目前的替代方案，如复合模式的填料，越来越受欢迎，特别是作为精纯层析步骤。使用传统体积排阻时的规模限制可以通过使用基于排阻的外核以及内核中的结合模式的流穿技术来适应。无论LVV物料是由基于瞬时转染的上游工艺或稳定PCL所产生，一种显著降低HCP和DNA水平、同时去除聚体的精纯形式，可以在确保终产品质量方面发挥重要作用。通常在工艺的这一阶段，聚集/粒径分布对最终收率和纯度的影响最大。
图4. 连续层析/生产
虽然层析法通常是LVV工艺中捕获的首选方法，但在某些情况下，切向流动过滤 (TFF) 可被用作一种替代方法。这主要是由于其在缓冲液成分置换中的灵活性、去除HCP和DNA的能力，以及在进一步处理前进行浓缩的能力。尽管如此，使用中空纤维或平板膜包TFF都需要足够的表面积来应对进样料液的浊度和复杂性，特别是稳定PCL。所需的通量和连续再循环可能会导致膜污垢，特别是在较大的工艺体积条件下，这需要谨慎的工艺开发工作。单通过TFF是一项新兴技术，它允许流动通过足够的膜面积，而不存在回流和污染的潜在隐患，从而实现其优势。然而，对于LVV下游工艺而言，这种方法仍然是相当新的，它是否会取代现有的技术还有待观察。虽然TFF通常不会在LVV下游工艺的早期使用，这突显了当前技术领域一个反复出现的问题 - 切向流和层析单元操作都是针对mAb工艺专门开发的，可能不适合更大、更复杂的生物分子，如LVV。
通常，在这一阶段，载体物料的浓缩和再制剂是通过TFF步骤实现的，在TFF步骤中，制剂通常是蛋白质、糖、脂类和盐的复杂混合物。工艺的这一部分对于确定最终浓度以及随后每个患者对最终载体物料的剂量要求非常重要。因此，在工艺的这一阶段，产物的浓缩和再循环的性质可以对LVV施加特定的负担，这可能会导致剪切和聚集。对于稳定PCL工艺来说，由于可能达到更高的细胞密度，这尤其具有挑战性，而灌流等上游技术的引入可能会加剧这一问题，灌流技术可能会产生更高浓度的工艺相关杂质和LVV。因此，在下游工艺早期提高选择性和产物质量变得越来越重要。
至关重要的是，在更早的单元操作中，最终制剂的选择和之前的缓冲系统对纯化程度以及后期的聚集情况有很大的影响，这是影响除菌过滤的主要因素之一。事实上，任何LVV工艺中最重要的节点都是生物负荷降低步骤。无论载体是通过瞬时转染还是基于稳定PCL的工艺所生产的，最终过滤器导致的严重损失仍然是整个行业的一个问题。聚集特性对通过0.2µm过滤器而获得高步骤回收率造成了很大的负担。也许正是由于这个原因，稳定PCL工艺提供了更大的能力，以扩大规模并生产更大的批次量，提高可重现性。正是这种可重现性，有助于建立正确的策略，以最大限度地减少这一步骤中看到的损失。
开发LVV下游工艺的能力是由可用的分析能力所驱动的。针对LVV工艺 (基于瞬时和稳定PCL)的快速(或在线)过程中分析方法的开发正在进行中。目前，主要依赖于传染性滴度测定，这些测定需要几天的时间。这可能意味着慢病毒的下游工艺很大程度上可能是在“盲”运行，直到某个时间点分析完成。尽管如此，分析领域，如光谱学 (即DLS、SLS、UV- Vis光谱、质谱)、成像(TEM)、颗粒分析 (TRPS或NTA、微流控分析仪)在提供工艺性能的早期反馈方面变得越来越重要。虽然其中一些技术仍处于起步阶段，但很明显，随着工艺向连续生产的方向发展，它们将成为提供重要信息的关键。
对于LVV生产来说，稳定PCL在连续生产工艺的开发中显然具有优势(图4)。这可能会降低设备的规模和尺寸，并允许实现批次间一致性和稳定性的改善，因为减少了开始到结束的时间。使用这种工艺可以利用单元操作的潜在优势，如作为连续收获过滤形式的单通过TFF，以及用于捕获LVV的亲和层析。这两个单元操作对于载体生产可应用性方面的发展还处于早期阶段，但显示了在使用稳定PCL进行LVV生产时可能实现的工艺强化的潜力。
总结
在本文中，我们介绍了稳定PCL可能提供的显著优势，以及目前在使用这些技术时所面临的一些上、下游工艺挑战。在某些情况下，基于瞬时转染的工艺仍然可以被认为是稳定PCL的一种替代方案，例如，开发针对编码较大或细胞毒性转基因LVV的稳定PCL面临挑战，或在最终确认目标序列前提供早期临床研究物料时。然而，应当指出的是，在规划和开发临床和商业化阶段的工艺时，应当考虑在引入生产工艺变更时证明可比性。最近，已经出现了由于可比性的证明而导致基因治疗产品推出的延误。因此，早期开发基于稳定PCL的商业化LVV生产工艺可能有利于在产品生命周期中最大限度地减少工艺变更，并减少为证明此类变更所需要的可比性研究的数量。消除对这些研究的要求还将减少与它们的执行和提交给监管当局相关的时间、资源和风险。
总之，很明显，引入稳定PCL进行LVV批量生产具有巨大的潜力，可提高工艺产量，提高批次间一致性，保证供应并降低商品成本，以满足患者群体更大的适应症（如肿瘤）的LVV临床和商业化供应需求。然而，需要进一步的创新和工艺表征来开发高产、稳健、商业化的LVV生产工艺，以确保这些革命性药物能够供应给患者。
原文：P.Archibald, A.Shillings, Enabling development of commercial-ready lentiviral vector manufacturing processes using stable producer cell lines. Cell & GeneTherapy Insights, 2021.
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