病毒载体的病毒安全性：当病毒是产品时所产生的特殊担忧
本文节选自《Viral Safety of Viral Vectors: Special Concerns Arise When the Virus Is the Product》，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
任何专注于研究工艺污染物宿主细胞蛋白的人都会告诉你，试图从许多相似分子的混合物中纯化一种特定类型的分子，就像在一大堆不同的针中找到几根特殊的针一样。从细胞培养液中纯化病毒载体也是如此。当病毒是产品时，不需要的病毒是必须被分离的污染物 - 或者更好的是，从一开始就阻止它的存在。
病毒安全性是生物药下游工艺的一个关键方面，特别是源于哺乳动物细胞系的生物制品。这不仅是为了保护患者不受感染；它还与保护药物免受不必要的免疫反应有关。这种反应降低了腺病毒作为基因治疗载体的早期希望 - 一些血清型在环境中普遍存在，以至于许多患者已经准备好对它们的存在进行攻击。更糟糕的是，一些人的身体可能会过度反应，导致“灾难性”的结果。
目前，最有希望和最受欢迎的基因治疗载体是腺相关病毒和慢病毒。它们的粒径都相对较小(图1)，因为小，对于下游工艺整体来说，挑战会更大；使用可以让蛋白质和更小的病毒透过的过滤器来捕捉细菌和大病毒更加容易，而一些令人担忧的外源性物质也相对较小。毕竟，人类免疫缺陷病毒(HIV)是一种慢病毒，而且实际上是正在开发中的载体之一(当然是得到保护和“消除”的)。细小病毒不仅只有HIV的一半大小，而且在结构上是线性的，这使它们有可能挤过纳米过滤器的膜孔。因此，工艺工程师必须开发产品的其它理化性质，以防止细小病毒污染。再次强调，最好是防止这成为一个问题，但你也需要一个工艺，以证明有能力清除外源性物质，以防万一。
图1：两个腺病毒颗粒被许多较小的腺相关病毒包围，放大约20万倍
所以病毒安全性不仅仅是病毒清除。它还包括使这些污染物灭活 -“杀死它们”或使它们无法复制 - 最重要的是，从一开始就远离它们。如果没有良好的检测方法用于工艺开发并确认结果，你就不能做任何这些事情。以下世界各地监管机构推荐的“三管齐下”的方法：
防止原材料污染
通过表征研究和常规测试，检测潜在污染物
消除污染物(灭活或去除)
预防最重要
如果任何动物源材料用于生物药生产的细胞培养基，它们必须通过质量确认可于良好生产规范(GMP)使用并经过除病毒过滤(由供应商或用户进行，或均进行)。在抗体和其它蛋白质的生物工艺过程中，这不是一个很重要的问题，近年来制造商越来越多地转向无动物来源的培养基成分。这一趋势是由朊病毒蛋白引起的传染性海绵状脑病(TSE)推动的，其比病毒更小，更难去除。但多年来，它也对病毒安全性倒是产生了积极的影响。
然而，许多基因和细胞治疗工艺来自学术环境，在那里，动物源性成分被更多地使用。当这些工艺进入工业环境时，有时公司会过于专注于规模放大/规模扩展和技术转移，以至于病毒安全性可能成为事后考虑项 - 尽管绝对不应该这样做。一些开发商在他们的上游工艺中忽略了使用除病毒过滤器，因为他们期望下游工艺来处理这些问题。但是，当许多培养基成分不稳定，不能采用常规的热灭活方法时，它们对于降低生物负荷来说就非常重要了。在2016年召开的非肠道药物协会(PDA)先进疗法病毒安全性第一次会议上，细胞、基因和组织疗法的“三管齐下”方法得到了更多的关注。
BPI编辑顾问Hazel Aranha说:“在病毒载体和基因治疗应用中，预防比传统生物工艺更加关键。两者的考虑是相似的，都强调原材料的来源、记录以及避免动物源性材料(ADM)。”
BPI在2021年6月的专题报告中强调了与细胞建库相关的、很少被考虑的挑战。我们收集了生物药开发商、合同制造组织以及其它行业合作伙伴关于建立、转移、处理和存储研究、主细胞库和工作细胞库(RCB、MCB、WCB)的最佳实践的印象。我与Aranha进行了跟进，重点研究了病毒载体生物工艺中的这些考虑。她是微生物学博士，拥有美国和欧盟的监管事务认证(RAC)，在学术界、工业界和咨询领域拥有超过30年的经验。她曾在Catalent Pharma Solutions等公司工作，主要从事病毒安全方面的工作。凭借她丰富的病毒学知识，近年来她将兴趣转向了基因疗法，特别是那些使用病毒载体的疗法。
她解释说，为了使先进治疗药物(ATMP)具有商业可行性，像其它生物药一样，建立MCB和WCB将是理想的选择。“然而，我们还没到那一步，”Aranha说。一些公司正在研究这种基于哺乳动物细胞培养物感染的基因治疗工艺的方法，但增殖的早期阶段仍然需要在添加血清的培养基中生长。这些细胞系将不得不脱离动物来源的营养，适应化学限定培养基。“许多公司仍在朝着这个目标努力。”
对于基因修饰细胞疗法，将遗传物质递送给供体细胞的病毒载体被认为是关键的原材料；或者，它是基因治疗的最终治疗性产品，不含细胞性治疗成分。无论如何，必须严格注意载体质量和相关文件。
Aranha建议说：“需要以所定的目标为起点。当目的是将一项操作推进到临床应用和商业化生产时，朝着这个目标努力是很重要的。使用适当等级的材料，并确保在建立和维护病毒载体细胞库以及用于生产它们的细胞系时采取最佳做法。”
她警告说，研究小组必须牢记最佳实践，因为早期在开发过程中使用的细胞以后可能会被用于意想不到的目的。除了制备临床研究物料外，可能还需要使用这些细胞和组织作为体内等效性数据解读的参考材料。
当一个基础研究方案被应用到临床研究时，试剂和起始物料的质量必须得到改善 -从“仅用于研究”到有文件记录、来源良好的物料。基因治疗工作通常只提供研究级材料；在这种情况下，监管机构建议使用可用的最高等级，并提供适当的文件。学术机构开发的新型ATMP使用研究级试剂和未经测试的起始材料通常不能提供生物生产所需的最低质量标准。
Aranha回忆说，在过去，研究小组会将他们需要的病毒载体的生产外包出去，这些载体通常基于他们自己内部开发的质粒。学者们将把GMP工作留给合同制造组织(CMO)，这些组织在法规遵从方面具有专业知识，了解并有能力满足GMP要求。现在，生物制药公司已经收购或建立了自己的研究小组，以生产潜在的基因治疗候选药物。这些团体会比纯粹的研究机构对整个工艺施加更多的控制。
“但请记住，”Aranha指出，“GMP对所有致力于ATMP生产的工厂都是强制性的，包括那些由学术机构运营的工厂。”关键方面包括质量保证和控制(QA/QC)、建立和维护表达系统，对关键质量属性(CQA)有明确的理解，通过标准操作程序(SOP)进行培训，风险管理策略，以及上述所有内容的最新文件。
表达系统的建立和维护包括培养对关键影响因素的透彻了解：真实性(身份、来源和确认基因型和/或表型特征)、纯度(无污染或其它)、在培养和冻存过程中的细胞系稳定性(基因型和表型)、以及体外系统的功能完整性。表达系统的标准化不仅在其建立过程中受到争议，而且在其随后的操作、维护、培养和未来几年的保存工作中也是如此。
保证所有材料的质量和方法的稳健性有助于公司保持其产品的完整性、有效性和可重复性。跟踪这些材料和方法所需的所有信息的文档化可以使工作在未来具有可重复性，并有助于审查员在试验性新药申请(IND)和上市许可申请时理解和评估工作。
为了保护个人和环境免受潜在危害，需要建立和保持足够的措施，如封闭系统、隔离屏障、洁净室，并为空气、物料和人员流动设置路线。遵守相关法律法规 – 以及道德原则 – 是ATMP特别关注的问题。所有这些都需要对所有人员进行适当的教育和培训，以促进安全和高质量的工作。
“当使用CMO时，”Aranha说，“确保你已经审核了该工厂，并有一个质量协议。获取与工艺相关的基本信息：材料质量、等级和可追溯性，并提供认证和声明，包括用于开发的批次的分析证书(CoA)。一些CMO有相关部门的药品主文件(DMF)，在这种情况下，一份授权书(LoA)就足够了。”
Aranha说，风险管理在评估生物生产过程的每个阶段以及评估规模放大/规模扩展程序的需求方面是至关重要的。“在美国，风险评估是隐含的；在欧洲和世界上许多其它地方，这是必需的。”
许多研究人员和公司使用人类胚胎肾(HEK293)细胞或草地贪夜蛾 (Sf9)昆虫细胞通过瞬时转染产生腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、腺病毒或慢病毒。杆状病毒表达载体系统(BEVS)的支持者“吹嘘”昆虫细胞相对于哺乳动物细胞在生产生物治疗药物方面的病毒安全性。几乎没有内源性或外来病毒能同时感染昆虫和人类。
为了保证产品的稳健性和同质性，用于临床/商业应用的细胞系必须进行分析，以记录其质量参数和属性。世界各国有关部门制定了许多针对GMP细胞库构建的法规和指导文件。例如，ICH Q5B提供了关于分析表达结构和用于开发MCB的细胞克隆的详细信息。ICH Q5D关于细胞系的衍生和表征的内容指出，其身份、纯度和稳定性(以及后续的细胞库)必须得到确认。
尽管整个生物制药行业在很大程度上已经不再使用像血清和特异性酶这样的ADM，但很少有病毒载体生产系统已经完全脱离了血清。在用于生产细胞系增殖的培养基配方中通常包括胎牛血清(FBS)和猪胰蛋白酶。Aranha警告说，即使不直接使用ADM，也可能使用源于ADM的添加物。“这对其它生物技术产品提出了同样的警告。一些公司在最初建立细胞库时使用血清添加物，然后随着时间的推移，通过降低其浓度，慢慢使细胞‘脱离’这些物质。”
使用胎牛血清会引起外来牛病毒和朊病毒的风险。因此，文件必须包括牛病毒的检测结果，并包括一份CoA，表明血清不是来自发现疯牛病的国家。猪胰蛋白酶带来了患者暴露于猪圆环病毒(PCV)的风险。在一种上市的轮状病毒疫苗感染PCV的案例中，新的诊断方法促进了它的检测，因此它们可以用于检测猪源材料，这些材料必须记录为该污染物的阴性结果。Aranha说，有充分文件记录的生产细胞系在没有这些文件记录的结果的情况下可能也可以使用，但是用户必须在自己内部进行这样的测试。她解释说:“一旦你的MCB被检测或证实有未接触这些物质的可接受历史，如果胎牛血清和猪胰蛋白酶的CoA包含适当的检测，并且来自经批准的地理位置，那么这些测试可能在随后的生产阶段被省略。”
显然，检测和记录检测结果是病毒安全性的重要组成部分，无论公司正在开发何种类型的生物制品。在谈到病毒安全性时，关键的分析方法包括基于聚合酶链反应(PCR)、基于细胞的传染性和免疫分析、体内动物测试和基于透射电镜(TEM)的分析方法。筛选方法的选择基于细胞底物的来源。尖端的下一代测序(NGS)只是刚刚开始用于检测亲代和建库的细胞系中的病毒和其它污染物。
原文：C.Scott, H.Aranha, Viral Safety of Viral Vectors: Special Concerns Arise When the VirusIs the Product. BioProcess International, 2021.
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