双特异性抗体下游纯化工艺
本文节选自“Current trends and challenges in the downstream purification of bispecific antibodies”，由于水平有限，详细内容，请参考原文或往期推送“双特异性抗体下游纯化的当前趋势和挑战”及“双特异性抗体下游纯化工艺：亲和 & 离子交换层析”。
基于粒径的纯化
粒径排阻层析法(SEC)是一种常用的纯化方法，它提供基于流体动力半径的分离，但由于可放大性问题，SEC的使用主要限于实验室规模的纯化工艺。生理pH下的磷酸盐缓冲盐水(PBS)似乎是一种常用的粒径排阻缓冲液，目标物和杂质之间的保留时间和分离分辨率取决于它们的分子量以及相应的流体动力半径差异。令人惊讶的是，使用Zenix SEC-300柱可以将bsAb从其亲本抗体中分离出来，尽管它们的流体动力学半径相似；虽然确切的机制尚不清楚，但由于硅珠被涂上了一层专有的化学键单分子层，除了粒径排阻外，它可能涉及微弱的疏水相互作用。值得注意的是，除了纯化目的外，基于粒径的方法，如SEC，也常用于bsAb纯度的分析表征，为存在的错配物质、聚体和被剪切的异构体提供有用的信息。
另一种可放大的、基于粒径的纯化方法是切向流过滤(TFF)。高性能TFF是一种基于筛分速率而将目标物与杂质分离的技术，最近有报道使用一种单级系统进行了此类操作，其由50cm2 C型筛网再生纤维素Pellicon XL膜包组成，截留分子量为300 kDa。尽管该工艺可以很好地去除bsAb聚体，但它也带来了额外的挑战，包括终产品体积较大，且需要更高的膜面积、洗滤缓冲液以及较长的处理时间。
基于疏水性的纯化
疏水作用层析 (HIC) 根据产物与杂质的疏水性的总体差异实现分离，在上样步骤中，通常使用高浓度的亲液（kosmotropic）盐 (如硫酸铵)，以促进bsAb表面暴露的非极性残基与填料之间的可逆相互作用，并在较低的盐浓度下进行洗脱。在某些情况下，HIC被提出用于从所需的不对称bsAb产物中分离同源二聚体错配副产物。有趣的是，对某些bsAb在HIC上的层析行为的研究发现了与层析表面不同的结合态对应的多峰洗脱行为，随着保留时间的延长，后期洗脱峰富集，保留时间的延长和较高的操作温度降低洗脱峰的分辨率，这表明在与层析分离相当的时间尺度上，构象发生了变化。也有报道称，过高的盐浓度可能导致填料与目标产物之间形成不可逆的疏水相互作用，导致整体收率较低。为了克服从填料中洗脱疏水蛋白的潜在困难，高达5%己二醇和1M精氨酸的流动相添加物被认为可有效促进bsAb的洗脱。
作为疏水层析的替代方法，使用拥挤剂或高盐作为疏水沉淀法纯化bsAb也被提出作为第一个纯化步骤或精纯步骤。在bsAb形成包涵体的情况下，纯化过程开始于一系列的洗涤步骤、复溶以及重折叠步骤。尽管这可能本身是一个多步骤的工艺，这种处理的优势是亲和层析步骤通常可在后续取消，因为可溶性宿主细胞蛋白质和杂质可在包涵体分离期间被去除，在洗涤、复溶和重折叠步骤中进一步去除不溶性杂质。
基于混合模式的纯化
通过组合和利用多种基本分离技术，混合模式纯化方法显示出了进一步提高现有纯化平台纯化能力的新潜力。例如陶瓷羟基磷灰石(CHT)，其是一种混合模式层析方法，提供基于bsAb表面胺和负电荷CHT填料磷酸基团之间的CEX分离，以及bsAb羧基与正电荷CHT填料钙位点之间的金属螯合。EQ通常在接近生理pH的磷酸盐缓冲液中进行，而bsAb则在EQ缓冲液中随着NaCl浓度的增加进行洗脱。混合模式填料的其它例子包括Toyopear lMX-Trp-650M、Capto adhere和Capto MMC，其是多模式离子交换填料，提供更多的相互作用，如氢键和疏水相互作用。这些填料的耐盐性有助于与Protein A或CEX后洗脱液直接交互，因此可以通过避免从工艺液流中去除促溶盐的步骤而进一步简化下游工艺。这些混合模式填料被认为能够去除错配的产物、聚体和片段，具体细节将在下面讨论。
去除错配产物和片段：Toyopear lMX-Trp 650M 混合模式填料已被证明可以从同源二聚体中连续分离含有К和λ LC的bsAb，含有К和λ LC的bsAbs以75mM NaCl洗脱，而λ和К同源二聚体可以流穿或以500mM NaCl洗脱。此外，Capto MMC ImpRes和Capto adhere ImpRes也被认为可有效用于精纯步骤，据报道，Capto MMC ImpRes能够通过加入额外的pH和NaCl漂洗步骤去除bsAb产物，如孔洞同源二聚体和半抗体；然而，这是在收率下降的情况下获得的，在30mg/mL的上样量下，报道的收率为40-50%。这一点，以及已经报道的用于洗脱的盐和pH值的不同组合，表明在使用这些混合模式填料时，为了获得高纯度和高收率的产物，仔细优化条件是至关重要的。
混合模式CHT层析也被证明在从不同bsAb中分离1/2和3/4抗体片段方面是有用的。使用Protein A后洗脱液，在一个案例中，包含~76% 1/2抗体（CrossMab表皮生长因子受体(EGFR)-胰岛素样生长因子(IGRF))，另一个案例中为~16% 1/2抗体形式、77% bsAb以及~ 6% 聚体(KiH血管生成素-2 (Ang2) /血管内皮生长因子(VEGF)以及第三个例子中为25% 1/2抗体、57% bsAb、14% 高分子量（HMW）物质 (KiH EGFR-IGFR)中，在较低的NaCl浓度下，观察到1/2抗体片段被洗脱，而在较高的NaCl浓度下，目标bsAb被洗脱，三个案例获得的总纯度分别为>80、>97和~97%。同样，将含有7.8% 3/4抗体片段和85% bsAb的Protein A后 CrossMab Ang2/VEGF洗脱液上样到CHT柱上，在NaCl梯度下洗脱峰的侧馏分中富集了3/4抗体，其中一馏分含有95% bsAb和1.5% 3/4抗体，另一馏分含有78% bsAb和9.1% 3/4抗体。
去除聚体：对于5/4 抗体 (多一个LC的抗体) 的分离，CHT也被提出能够从bsAb目标物中实现分离。使用含有~17% 5/4抗体的Protein A后 KiH TWEAK/IL17洗脱液，可以观察到5/4抗体在较高盐浓度下洗脱，而bsAb在较低盐浓度下洗脱。
总结和展望
全面了解目前bsAb下游纯化方法对于进一步开发优化工艺和新技术的重要性，从而推动工艺生产力和产品质量的全面提高，bsAb的巨大临床潜力进一步强调了这一点。与细胞系工程和细胞培养条件优化等上游工艺领域的大量进展相比，bsAb的新型下游纯化方法的开发报道较少。正如我们在这篇文章中看到的，大量的bsAb形式，以及产生的无数bsAb特异性副产物，使得开发有效的工艺具有不小的挑战性，特别是在有限的纯化步骤中获得高纯度和高产量的产物。
尽管Protein A和IMAC是迄今为止用于bsAb纯化的主要亲和纯化方法，靶向bsAb其它区域的亲和层析方法，如К或λ LC，在纯化有或没有Fc区域的bsAb方面可能有较大的应用潜力，特别是Protein L亲和层析，表现出了卓越的聚体去除性能。几十年的Protein A亲和纯化优化工作使得其性能已显著提高，填料成本大幅降低，而基于纤维的技术的最新进展，进一步突破了传统填料纯化方法的局限性，表明优化其它形式的亲和纯化，可以克服bsAb纯化的特定挑战，在未来可能会在提高bsAb纯化的整体生产力方面证明是有效的路径。
虽然基于电荷、粒径和/或疏水性的纯化方式经常被用作精纯方法，但也有一些报道将这些填料作为纯化bsAb的捕获步骤。考虑到与Protein A相比，使用CEX可以更有效地从目标对称bsAb中去除某些杂质，如双链抗体，CEX用于杂质去除和作为捕获步骤的潜在用途可以进一步研究和优化，特别是结合新的连续层析技术，可以进一步提高bsAb目标物和杂质之间的分离分辨率，而不影响产物收率。事实上，使用多柱逆流溶剂梯度纯化解决了收率和纯度之间的权衡难题，方法是在收集纯化bsAb组分的同时，将含bsAb目标物的侧馏分回收到一根单独的柱中。混合模式填料能够提供比传统方法更强的分离分辨率，这也表明在未来的工艺开发中，混合模式填料有相当大的应用潜力，这也鼓励了其它形式的混合模式填料的进一步开发。
最后，加入添加物，如盐和拥挤剂，已被证明在各种各样的纯化方法中，可以增强bsAb与杂质的分离，并可能在某些情况下改变bsAb与其各自配基的相互作用。我们观察到，与Protein A相比，在有盐添加物存在的情况下，Protein L中聚体-单体的增强分离机制有所不同，研究不同添加物在其它纯化模式中的作用，以及进一步开发bsAb与配基之间不同的物理化学性质和相互作用，以改进纯化结果，将是极有意义的工作。
原文：S.W.Chen, W.Zhang, Current trends and challenges in the downstream purification of bispecific antibodies. Antibody Therapeutics, 2021 Apr; 4(2): 73–88.
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