慢病毒载体的制剂和灌装：Part I – 工厂和工艺设计案例研究
本文节选自来自Oxford Biomedica的研究人员发表的文章“Formulation, Fill and Finish of Lentiviral Vectors: Part 1 — Case Study in Facility and Process Design”，由于水平有限，详细内容，请参考原文。
在过去的几年里，Oxford Biomedica Ltd. (OXB)在位于英国的病毒载体工艺设施中开发并建立了一个灌装平台(“Oxbox”，图1)。该设施包括四个隔开的病毒载体药物底物(VS)原液车间，其应用了封闭式系统和生物负荷控制工艺，两个病毒载体药物产品(VP)灌装车间，应用无菌工艺，随着产品产量需求的增加，通过规模扩展进行了空间扩增。分隔的车间使该工厂能够同时处理不同的病毒载体，包括OXB自己的LentiVector递送平台和其它类型的病毒载体，以及通过战略合作伙伴关系，作为合同开发和制造组织（CDMO）。
图1.Oxford Biomedica英国Oxbox病毒载体工厂
Oxbox工艺平台结合了一个应用生物负荷控制的VS合并阶段和VP浓缩工艺，后者包含一次性使用封闭系统以及之后的自动化小瓶灌装和集装箱式空间 - 在完全无菌工艺条件下，封闭在屏障隔离器技术内。该平台足够灵活，可以在不同条件下灌装病毒载体，覆盖范围广泛的体积浓缩因子和瓶-尺寸-灌装-体积组合。在Oxbox平台中处理的VS和VP要么用于基因递送，以支持基因修饰的自体或异体细胞治疗，要么作为体内基因治疗药物产品直接应用。
这个由两部分组成的案例研究的第1部分将着重于制剂-灌装工艺和工厂本身的设计。在之后的文章中，我们将讨论已解决的问题、已做出的决策、风险管理和病毒安全问题。
病毒载体产品需求
这种灵活的制剂和灌装组合平台的开发是由完全符合GMP要求的需求所驱动的。针对无菌药品生产EU GMP附录1，针对先进治疗药品(ATMP)的EU GMP Part 4，以及美国食品和药物管理局(FDA)针对无菌工艺生产的无菌产品指南提供了关键信息。为了满足这些需求，公司采用了先进技术和替代性工艺方法，遵循质量风险管理(QRM)原则，以及病毒遏制 (防止环境释放)，作为污染控制策略(CCS)的一部分，以针对转基因有机体(GMO)进行交叉污染控制。
近年来，针对新目标患者群体的一系列高调获批和临床开发的产品数量不断增加，证明了对基因和细胞治疗工艺的需求正在增加。为此，该行业需要开发新的工艺方法，以保持产品质量，特别是在无菌保证方面。
在基于细胞的ATMP的生产过程中，通常使用封闭系统工艺：细胞培养、纯化和随后的人工处理操作在微生物安全柜(MSC)内进行。这种方法通常用于制备自体(单患者)治疗和一些基于病毒载体的细胞工艺的早期临床开发。
当开放式工艺步骤在MSC中使用时，产品或底物会在一定的时间内暴露在工艺环境中。因此，该方法只能提供有限的保护，以使产品免受外来污染，这些污染(如果存在)可能会伤害患者和/或危及产品的效力。MSC的设计是为了确保操作人员的安全，通过控制气流以及维护一个清洁的空气环境，其主要针对细胞/组织培养等应用。OXB尽可能地采用封闭系统工艺，将低生物负荷的潜在环境暴露限制在少量的开放式工艺步骤中。
在设计Oxbox工厂时，公司认识到这种方法适用于VS生产。然而，利用在与合同制造伙伴开发之前的VP工艺中获得的知识，OXB选择在除菌过滤后采用更精细的VP处理方法来保持适当的无菌保证。监管机构鼓励针对无菌工艺阶段(如灌装或在除菌过滤后执行的其它无菌工艺步骤)的符合GMP的批次生产开发适当的方法，这些方法采用先进的隔离屏障技术并集成自动化。这些方法支持监管机构对人员和工艺分离的期望，工艺设计遵循QRM和质量源于设计(QbD)原则，将技术作为技术性污染控制措施应用。此外，监管机构要求GMP生产商紧跟科学技术的进步，通常会鼓励采用新技术。
针对未满足患者需求的基因和细胞治疗的持续发展 - 特别是需求不断增加的适应症 - 需要新的方法来提供更好的风险管理，并确保无菌性。当病毒载体将用于进一步的体外基因治疗工艺中时，例如，嵌合抗原受体(CAR)T细胞，它将不会直接或立即给药给患者。然而，这类情况需要承担与直接给药产品(如病毒载体基因疗法)相同的无菌保证要求。
因此，我们的方法是开发一种无菌工艺和灌装能力，目标是达到无菌保证的最高标准，以服务于体内和体外治疗两种情况。
为了最大限度地保证灌装操作的无菌性，无菌工艺中间体暴露于A级工艺环境中。目前的想法是，从高度手动的基于MSC的灌装工艺转向采用自动化无菌工艺设备和屏障技术：隔离器和限制进入屏障系统(RABS)。病毒载体提高了工艺的难度：这类产品通常需要冷冻或低温保存，从原液制剂到灌装、目视检查、贴标签和二次包装的所有工艺步骤都有一个必要的“解冻-冷冻”稳定工艺时间窗口。灌装只是这个过程的一部分，必须从整体上考虑，这样整个过程才会有效，每一步都可以尽可能快速简单地与下一步整合在一起。
清洗残留物：无菌工艺的另一个主要挑战是用于工艺环境和综合设备生物净化的消毒剂 (包括杀孢子剂和生物剂)的残留物。例如，残留的过氧化氢蒸汽 (VHP或vH2O2)会影响生物制品的功能 (效力)。特别是囊膜病毒产物(如慢病毒载体)对H2O2的氧化电位和自由基攻击机制高度敏感。
VHP也是一种有效的交叉污染控制措施，用于不同产品之间的病毒清除。常规/化学药品的普遍共识是在工艺开始前将H2O2清洗至1ppm的残留水平。然而，对于病毒载体来说，推荐显著更低的背景水平(0.1ppm)以降低产品失活的风险。
Oxbox案例研究最初是在国际制药工程师学会(ISPE)2020无菌大会上提出的，在灌装平台安装后，在2021年报告了后续研究，使用培养基灌装模拟确认工艺指向无菌工艺。
工厂和工艺设计：关键驱动和决策
Oxbox工厂的设计改造自一个原来用作邮政分拣办公室的大型现有建筑。这个7800平方米的开放式设施只有很少的支撑柱且空间高度较高(>9米)。这样的空间为VS/VP生产的专用工艺设施提供了完美的“外壳”。这种方法减少了整个项目的执行时间，允许在项目的早期阶段部分占用场地，以促进与建筑师、工程师和施工团队的直接现场互动。
工艺设计中的关键决策：从一开始，工厂设计就基于带有独立空气处理单元的专用车间，以提供区域-工艺隔离，每个都带有气闸，以形成一个包含负水槽和正气泡的压力级联，用于遏制病毒和交叉污染控制。走廊连接不同的车间和中心区：仓储、微生物实验室、一般更衣区等等。车间的设计基于人、材料、产品和废物单向流动的基本理念。这是通过结合单独的入口和出口材料和人员气闸(MAL、PAL)以及用于样品和工艺中间体的传输舱口来实现的。产品和废弃物通过MAL及时分离出洁净室。
构建了四个独立的VS车间，用于处理新鲜或冷冻的病毒载体底物。在需要时，载体底物的解冻在VS车间外的受控工艺区进行，封闭容器的解冻在注射用水(WFI)浴中完成。
工厂设计有两个灌装车间。其中每一个都包括一个具有隔离技术的GMPC级灌装室，以及一个单独的区域，该区域位于清洁的非分类(CNC)区域，用于接收/转移灌装产品，该区域有一个专用的D级MAL。目视检查室内还安装了贴标签和二次包装设备，以便在每个车间内加工特定产品，并在不同的灌装车间之间提供交叉污染控制措施。
两个并排的灌装车间最初建立在相同的设计上，因此提供了所需灵活性，以安装不同的灌装技术平台，以备未来之需。工厂和工艺设计的关键是支持规模扩展的概念，而不是规模放大，以增加产品的产出能力。工厂提供了扩展空间，以复制相同的合格工艺车间，包括合格的技术以及连接到中央设施的走廊。
两个灌装车间中的一个已完成并配备齐全，第二条线将根据需求进行配置。对灌装平台的要求发送给了不同的供应商，并对他们的回复进行了彻底评审。OXB选择了Franz Ziel GmbH的屏障技术和Watson-Marlow Flexicon A/S的灌装技术。他们的设计提供了最大的灵活性，可实现灌装过程的适应性和持续发展。图2和图3显示了制剂和灌装线的布局，它提供了与速度和安全性相关的显著的工艺优势。互联的工艺区基于隔离屏障技术与封闭的材料转移系统，其可提供隔离器内的病毒控制，并可促进快速工艺/工艺阶段之间的过渡，以满足工艺时间限制。
图2. 灌装车间
发现灵活性：一次性使用系统(SUS)和即取即用（RTU）预灭菌产品容器(瓶)和闭包提供了必要的灵活性。基于专用灌装车间内的屏障技术，制剂和灌装组合平台(图3)被指定用于灌装RTU产品容器(1类硼硅玻璃瓶)和闭包(弹性塞子和带翻盖的铝压接)。产品和缓冲原液容器(袋)和液体流路，包括灌装针，都是预灭菌的SUS。
图3. 病毒载体制剂和灌装组合平台
OXB VS工艺经过优化，减少了缓冲液的体积和所需的WFI(生产合同外包)。Oxbox工厂的空间设计有现场WFI生成系统；但是，系统的安装推迟到今后各阶段，直到需求量增加。由于该工厂目前没有安装WFI系统来供应高压灭菌系统，因此决定将重点放在使用预灭菌单元进行VS/VP生产活动上，所以灭菌过程也被外包出去。
该措施的一个例外是与产品直接接触的部件的灭菌有关，包括接触塞子的部件 (盆、滑槽、导轨和夹钳)。生物负荷控制是通过转移和装配，然后在无菌灌装过程开始之前在隔离屏障技术的在位VHP实现的。
与产品直接接触的部件在批量生产操作使用前需要再处理(清洗灭菌)。因此，需要现场灭菌。这些部件相对较小，由316L不锈钢实心件加工而成，暴露在高温下不会熔化或变形。因此，它们适用于干热灭菌，OXB认为干热灭菌比指定一个湿热灭菌高压锅更易于现场管理。干热烘箱可以在较高的去热原温度下工作，因此该工艺也可以去热原，为直接接触部件提供内毒素控制措施。
干热烘箱位于辅助D级洁净室中，远离C级灌装室。在从灭菌/去热原区到灌装车间的转移操作中，确保直接接触部件端到端无菌的再处理关键是耐热包装的来源和应用。可(通过热密封)封闭外部环境，以保持无菌屏障，直到部件被放置到隔离器。
灌装隔离器内的直接产品接触部件
无接触转移：由于残留的VHP会影响病毒载体功能，需要另一种方法将预灭菌RTU容器转移到A级灌装区。指定无接触转移(NTT)是因为在转移到A级隔离器期间不需要使用消毒剂。NTT已被开发并认证为一种具有半自动化和全自动化的拆包技术的替代方法，该方法遵循QRM和GMP原则，在其两个拆包转移步骤中没有应用消毒步骤。
在无菌屏障(一个塑料托盘密封的Tyvek盖)内的RTU容器(小瓶)在生产中是合格的，无菌屏障的外部也是无菌的(适用于NTT工艺)，并在整个供应链中保持这种状态，直到使用点NTT转移。通过灌装线上的过程中NTT转移，无菌屏障不会被暴露A级以下区域，它提供了一个合理的解释，即物料从C级工艺室通过NTT转移至A级隔离器时，可消除外部包装的消毒步骤。
这种方法的另一个好处是缩短了生产启动时间。由于针对RTU小瓶的无菌屏障的材料消毒中没有使用VHP (VHP是可渗透的)，曝气时间不需要考虑小瓶脱气。还需要注意的是，NTT能够按需提供无菌容器，以支持增加的灌装速度和批量大小，而无需在工艺开始在隔离器内预先载入所有小瓶。
原文：L.Southam, J.L.Drinkwater, Formulation, Fill and Finish of Lentiviral Vectors: Part 1 —Case Study in Facility and Process Design. BioProcess International, 2021.
相关阅读：