生物治疗药物的蛋白质聚集和免疫原性：制剂开发和生物工艺考量
重组蛋白是生物制药的中流砥柱。蛋白质生物产品的生产和制剂中的一个关键挑战是活性药物成分聚集的趋势，导致不可逆的药物损失和免疫原性风险的增加。虽然在文献中已经广泛讨论了蛋白质聚集的分子机制，但在将生物治疗药物的免疫原性现象联系起来方面仍然存在知识空白。在文中，作者讨论了推动药物重组蛋白聚集的因素，并强调了可以在从制剂到生物生产的开发阶段部署的预测和缓解方法。文章目的是激发新的对话，将生物治疗药物中蛋白质聚体的物理特性与免疫系统的功能属性联系起来。
制剂开发考量
通常认为，通过精心设计制剂因素，包括活性成分、缓冲液和赋形剂的浓度，可以在开发早期预测和预防生物制药中的蛋白质聚集。蛋白质药物的浓度直接影响系统的胶体稳定性，从而影响其聚集趋势。胶体稳定性通常以渗透第二维里系数报告，该系数通过静态或动态光散射检测。一种常规方法是绘制一系列蛋白质浓度与光散射强度的图，以建立线性回归函数(B22)，该函数可用于推断蛋白质在给定浓度下的聚集行为。然而，这种线性回归形式的有效性仅在低浓度蛋白质制剂（<10 mg/mL）中得到证实。在高浓度系统（>50 mg/ml）中，蛋白质粒度和光散射的变化可能以非线性方式表现。就空间排斥、范德华引力和长距离静电相互作用而言，蛋白质-蛋白质相互作用在高浓度蛋白质制剂中被“夸大”了。Kumar等人揭示了在高浓度蛋白质产品中，聚集主要受短距离疏水相互作用控制，而长距离静电力促进稀释制剂中的聚集。因此，应用相同的线性预测方法来分析高度浓缩产品中的聚集行为是不合适的。
为了解决这种差异，Hofmann等人构建了一个模型，可以识别一系列蛋白质浓度的内在蛋白质聚集。该方法首先需要在低浓度范围(<10 mg/mL) 中建立线性拟合，然后确定在拟合范围之外的浓缩系统(40 mg/mL) 的测量散射和外推散射强度之间的偏差。当将预测的胶体稳定性与优化模型和来自DLS 和 SEC 技术的实时稳定性数据（10 至20 周读数）进行比较时，发现预测方法可用于定性排序Fc 融合蛋白、单域抗体和单克隆抗体制剂在不同的pH 值下的聚集趋势。该研究代表了在制剂筛选阶段优化蛋白质聚集预测的持续努力。
由于蛋白质稳定性通常取决于 pH 值和离子强度，因此制剂阶段的关键步骤是筛选最佳缓冲液和盐成分。一种常见的方法是使用差示扫描荧光法(DSF) 在各种 pH 值和离子条件下检查蛋白质的热解折叠。传统的 DSF 涉及疏水性荧光染料，例如 SYPRO Orange 或1-苯胺基-8-萘磺酸盐 (ANS)，它们在亲水环境中淬灭，但在暴露于变性蛋白质中的疏水区域时会发出荧光。随着蛋白质通过诱导性加热解折叠，蛋白质疏水残基暴露出来，导致荧光增加。解折叠转变中点温度(Tm) 反映了构象稳定性。Moggridge 等人使用实时 DSF表明，溶解在不同磷酸盐和磺酸缓冲液中的人IgG (10 mg/mL) 在 pH 5.0 到 10 时保持热稳定性；人IgG 在 pH 7.0 的 1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES) 缓冲液中保持最高的热稳定性。一种可能的解释是，根据Hofmeister 系列，磺酸根离子比标准磷酸盐缓冲液中的磷酸根离子发挥更大的蛋白质稳定作用（“盐入”）。在存在氧化蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸、酪氨酸和蛋白质组氨酸残基的自由基发生器的情况下，IgG的 Tm 降低了 8°C，表明蛋白质稳定性降低。因此，控制蛋白质制剂中氧化剂的水平很重要，因为在氨基酸氧化时，会显示出更多相互作用的区域以进行聚集。
虽然 DSF 可以成为高通量筛选聚集的强大工具，但一个限制是制剂中的添加物可能表现出自发荧光或与报告染料相互作用。Kroeger等人报道，SYPRO 染料的DSF 漂移是由其与常见赋形剂乙二胺四乙酸(EDTA) 的相互作用引起的，而不是与未折叠蛋白的相互作用。为了克服这种干扰，开发了最新一代的DSF 仪器 Prometheus NT.48 (NanoTemper Technologies)，以无标记方式检测特定领域的解折叠跃迁和聚集温度。Prometheus 不使用荧光染料，而是监测目标蛋白质中疏水氨基酸（例如色氨酸和酪氨酸）的内在荧光。该仪器可在数分钟内完成对各种蛋白质浓度（5ug 至 150 mg/mL）的扫描。由于只需要几微升的样品，因此可以放大实验室方法，以监测生产阶段的稳定性。
除了优化浓度、缓冲液和离子强度外，还可以使用离液剂和共溶剂等添加物来稳定溶液中的蛋白质。诸如氯化镁之类的离液剂和诸如尿素之类的变性剂通过破坏蛋白质的分子内氢键并消除疏水折拢的熵诱因来提高蛋白质溶解度并降低聚集倾向。尿素与氢原子相互作用并置换大量水，导致将水结构释放到大量水中的自由度增益较低，从而导致疏水折拢。结果，系统偏离了聚集倾向。另一方面，硫酸镁等共溶剂可稳定水结构的形成并促进疏水性聚集。添加物浓度的确定至关重要，因为高浓度的共溶剂会将蛋白质盐析到溶液中，而高浓度的离液剂会使天然蛋白质变性。因为盐和蛋白质之间的相互作用是基于静电的，所以确定合适的盐水平在很大程度上取决于pH 值、蛋白质浓度和 pI。此外，溶解由共价键引起的聚集需要还原剂，例如二硫苏糖醇和β-巯基乙醇。这些试剂上的硫醇将减少半胱氨酸残基之间的非天然二硫键，从而溶解共价聚体。然而，这些强还原剂很少包含在最终制剂中，因为它们也会破坏天然蛋白质构象所需的二硫键。
生物工艺考量
上游生物生产 - 生产后去除聚体的成本可能很高。因此，最常见的方法是优化工艺参数以减少生物生产过程中的聚体。Paul等人利用实验设计 (DoE) 通过监测蛋白质聚集来优化mAb 生物工艺参数。这是一种独特的方法，因为之前的工作强调通过优化糖基化而不是直接控制聚集过程来提高产量。这项工作涉及系统地解决温度、pH、渗透压、搅拌、消泡剂和丙戊酸（VPA，一种常见的培养添加剂）对中国仓鼠卵巢 (CHO) 细胞培养物中 mAb 聚集的影响。作者研究了可溶性聚体和聚体颗粒。与其它参数相比，pH的影响最小，这可能是由于与测试的CHO 细胞兼容的范围较窄（6.8、7.2 和7.6）。VPA，添加用于增强哺乳动物细胞培养物中的蛋白质表达，被发现是唯一能诱导可溶性聚体的添加物。在长时间保持高温的情况下发现聚体增加，所以建议应在72 小时后调节温度变化。低于 32°C 的温度调节会减少聚体颗粒，而发生在 32-34°C 和 33-35°C 的温度变化会增加颗粒的形成。
Kaisermayer等人也使用DoE 来确定在 CHO 细胞中培养促红细胞生成素融合蛋白 (Epo-Fc) 的最佳温度和 pH。与Paul等人的研究不同，Kaisermayer 等人专注于pH和温度与聚集之间的相互作用。从 28.5 °C 到 38.5 °C，与低pH 值相比，高 pH 值下的聚集倾向更高。在高 pH 水平下，升高温度会略微降低蛋白质聚体百分比。相反，在低pH 值下，温度升高会增加蛋白质聚集。将温度和pH 从 37°C、pH 7.05 调整到30°C、pH 6.75可协同地将 Epo-Fc 蛋白聚集从75% 降低到 0.7%。这一结果与最近的一项专利一致，该专利表明在降低温度 (27 °C - ≤ 30 °C) 和降低 pH (6.8 - ≤ 7) 条件下培养的哺乳动物细胞培养物中产生治疗性蛋白质可显著减少蛋白质错误折叠和聚集。总之，这些最近的报告表明，标准化的37 °C、pH 7.0 可能不是治疗性蛋白质合成的最佳细胞培养物。相反，在正确的时间稍微降低温度和 pH 值可以最大限度地减少蛋白质聚集并提高产物质量。这些研究还强调了利用系统性 DoE 方法优化生物工艺的重要性，因为参数之间存在非线性和交叉反应效应。
尽管哺乳动物细胞培养物（主要是 CHO 细胞）是目前治疗性蛋白质合成的标准宿主，但许多无细胞蛋白质合成 (CFPS) 方法正被开发成为高通量和强化控制策略。在 CFPS 方法中，酶成分从细胞裂解物中提取，然后通过添加外部必需底物（如核苷酸、DNA、mRNA、能量因子等）用于促进翻译、转录和蛋白质折叠。过去几年，CFPS的发展逐渐从基于原核生物的过程转向基于真核生物的过程，从合成小蛋白片段到合成完整的单克隆抗体。规模和复杂性的增加也增加了聚体的风险。
2017 年，Martin等人第一个报告了用于合成 mAb 的基于CHO 的无细胞平台。该研究的一个关键发现是，当独立于轻链合成时，重链会形成更多的聚体，这表明前者有助于后者的折叠和稳定性。因此，首先添加轻链质粒并将重链质粒的添加从蛋白质合成检测时间延迟 6小时有助于最大限度地减少这种基于CHO 的 CFPS中的聚集倾向。研究没有观察到轻链与重链质粒比率对蛋白质聚集的显著影响。该研究的一个缺点是使用单一方法（蛋白质印迹）评估蛋白质聚集。正交方法，如圆二色谱或SEC，对于识别聚体的类型以及将聚集水平与工艺参数相关联是必要的。与基于细胞的生物反应器相比，无细胞平台允许更灵活地进行原位操作和直接采样，因为蛋白质合成发生在细胞外。然而，CFPS需要不同范围的参数，在工业规模实施之前需要确定对聚集的影响。
下游生物工艺 - 在蛋白质纯化过程中，聚集是一个重要的障碍。标准抗体纯化需要依次用葡萄球菌Protein A填料层析捕获API、去除污染、酸性处理(pH 3.5)、pH中和、精纯以及过滤。Protein A(或Protein G)因其与抗体以及含Fc蛋白的Fc结构域的可逆且特异性结合而被广泛应用。Protein A填料柱对蛋白质的吸附和解吸过程往往会改变纯化后蛋白质周围的水合层，从而改变蛋白质的构象，增加聚集倾向。此外，蛋白质可能会在酸性洗脱步骤中变性，从而增加聚集的风险。
有研究提出，层析结合和洗脱工艺也可用于去除产物中的聚体。Yu等人发现，来自上游细胞培养的mAb聚体与Protein A填料的结合比mAb单体更强。此外，抗体间Fab-Fab和Fc-Fc相互作用的聚体更紧密，可能比Fab-Fab的聚体与更多的Protein A配基结合。因此，与Protein A亲和性的差异提供了一个机会，以在纯化的开始步骤中去除抗体聚体。Dileo等人发现，优化后的pH值和Protein A填料选择过程可使mAb聚体减少25-30%，Protein A洗脱产物的高分子量聚体从澄清后培养液的18%降低到12%。还有研究建议在洗脱前添加低pH的漂洗液 (但高于洗脱所需的pH值)，可以提高最终产品的质量。虽然pH漂移可以诱导聚集，但一个精心设计的pH过渡体系是有利的。
已经开发了Protein A 层析法的替代品。Inomata等报道了一种使用耐碱RNA 适配体的填料柱，其可以特异性结合IgG 并在中性 pH 条件下螯合解离。Scheffel等人开发了一种Protein A 衍生结构域，ZCa，它使用 EDTA 在中性pH 条件下以钙依赖性方式结合和洗脱抗体。这些新技术的成功商业化将取决于与现有方法相比提高产量的证明。
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原文：N.B.Pham, W.S.Meng, Protein Aggregation and Immunogenicity of Biotherapeutics.Int J Pharm. 2020, 30; 585: 119523.
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